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Filippo ROSSELLI
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Anémie de Fanconi et réparation des pontages de l’ADN, groupe de Filippo Rosselli



Filippo ROSSELLI - CNRS

Travaux et objectifs

Nous étudions la réponse cellulaire et moléculaire aux agents endommageant l’ADN, en utilisant comme modèle principal les cellules issues de patients atteints de l’anémie (ou maladie) de Fanconi (AF), un syndrome génétique rare qui associe défaillance hématologique et prédisposition à certains cancers. Nous portons notre attention plus particulièrement sur les mécanismes de réparation des pontages de l’ADN, lésions induites par de nombreuses drogues utilisées contre des pathologies d’hyperproliferation comme le cancer ou le psoriasis.

L'AF est un syndrome génétique humain rare à hérédité récessive, caractérisée par le développement d’une aplasie médullaire progressive, une prédisposition aux cancers, une instabilité chromosomique et une hypersensibilité aux dommages à l'ADN. Parmi les cancers les plus fréquents développés par 30 % des patients au cours de leur vie on retrouve les leucémies myéloïdes aigues, les cancers hépatiques et ceux des voies aérodigestives supérieures (VADS).

Génétiquement hétérogène, l’AF est liée à des mutations homozygotes dans au moins quinze gènes différents (FANCA à FANCP). Les quinze protéines FANC sont classées en trois groupes : le premier assemble les huit protéines qui constituent le complexe FANCcore, responsable de l'ubiquitinylation des protéines du deuxième groupe, FANCD2 et FANCI. Cette modification est nécessaire pour permettre l’assemblage de ce dimère dans des foyers nucléaires où il a un rôle encore indéterminé dans la résolution des problèmes de réplication et dans le processus de recombinaison auquel participent les cinq protéines du groupe III. Bien que leur activité biochimique et leur rôle moléculaire soit encore peu compris, il apparaît clairement que les protéines FANC font partie d'un réseau complexe auquel participent des composants de la chromatine (H2AX, BRG1), des protéines de signalisation (ATM, ATR), des protéines détectrices des dommages ou adaptatrices (RPA, complexe RAD50-MRE11-NBS1, BRCA1), des hélicases (BLM), des protéines impliquées dans d'autres voies de réparation de l'ADN comme le la réparation par excision de nucléotides (XP-F) et la recombinaison homologue (RAD51).

Travaux récents de l’équipe

1. Voie FANC & CHK1
Nous avons montré l’implication de CHK1 dans l’activation de la voie FANC et identifié une boucle de régulation dans laquelle CHK1 participe et permet la mono-ubiquitinylation de FANCD2, qui, à son tour, promeut la dégradation de la forme phosphorylée de CHK1, facilitant la reprise du cycle cellulaire (Guervilly et al., Hum. Mol. Genet., 2008 et 2011).
2. Voie FANC & NEIL1
Nous avons montré que la glycosylase NEIL1, acteur majeur du système de réparation par excision de base (BER), intervient dans la réparation des monoadduits induits par les agents pontant l’AD,N ainsi que dans l’élimination d’un intermédiaire particulier qui se forme tardivement au cours de l’élimination d’un pontage (Couvé-Privat et al., Nucl. Acid. Res., 2007 et J. Biol. Chem., 2009). Enfin (Macé-Aimé et al., Environ. Mol. Mutag., 2010), nous montrons que l’expression de NEIL1 est fortement diminuée dans les cellules AF, ce qui a un rôle dans leur sensibilité aux agents pontants.
3. Voie FANC et réplication virale
Nous avons mis en évidence un rôle de la voie FANC dans le processus de recombinaison associé à la réplication d’un adénovirus (Cherubini et al., 2011).
4. Voie FANC et division cellulaire
Nous avons montré que certains problèmes rencontrés lors de la réplication, en particulier au niveau des sites chromosomiques fragiles, donnent lieu à la formation de ponts d’ADN entre les chromatides sœurs qui deviennent observables à l’anaphase. Les protéines FANC permettent l’action de l’hélicase BLM (mutée dans le syndrome de Bloom, autre syndrome de prédisposition aux cancers) impliquée dans la résolution de ces ponts anaphasiques. L’altération de ce mécanisme induit des changements de ploïdie dans la descendance cellulaire, ce qui peut avoir un rôle majeur dans la prédisposition aux tumeurs de l’AF et du Syndrome de Bloom (Naim & Rosselli, Nature Cell Biology, 2009 et Cell cycle, 2009).

Travaux en cours/projets

1. Voie FANC et réponse aux problèmes de réparation et de réplication de l’ADN
Le rôle majeur attribué à la voie FANC est de participer au maintien de la stabilité des fourches de réplication et/ou d’en permettre le redémarrage suite à leur arrêt causé par la présence d’une lésion dans l’ADN ou, plus simplement, de la séquence ou du contexte chromatinien de la région à répliquer. De ce fait, la voie est activée en réponse à tout type de lésion, même si son inactivation n’a d’effets cytotoxiques majeurs qu’en présence de pontages de l’ADN.
Pour mieux définir l’implication de la voie FANC dans la résolution des problèmes de réplication, nous allons déterminer les interactions biochimiques et fonctionnelles entre les protéines FANC et différents éléments impliqués dans le bon déroulement de la réplication en absence et en présence de lésions de l’ADN.
1.1. Voie Fanconi et réponse aux UV
Les lésions induites par les rayonnements ultraviolets constituent des obstacles majeurs à l’avancement des fourches de réplication et activent la mono-ubiquitinylation de FANCD2. Nous voulons définir le rôle de cette activation dans la réponse cellulaire et moléculaire aux UV. En particulier, nous nous intéressons aux interactions entre la voie FANC et le système de réparation par excision des nucléotides (NER), ainsi qu’avec les mécanismes de tolérance des lésions.
1.2 Voie FANC et chromatine
Dans les cellules eucaryotes, réplication et réparation des dommages de l'ADN se déroulent dans le contexte de la chromatine, une structure dynamique associant ADN et une classe majeure de protéines, les histones. Les modifications post-traductionnelles des histones (HPTM) ont été impliquées dans la réplication, la réparation de l'ADN et la ségrégation des chromosomes. Etudier la dynamique de la chromatine qui suit une perturbation de la réplication est un objectif majeur pour déchiffrer les mécanismes de fragilité chromosomique.
 A cette fin, nous déterminerons :
a) Les changements de HPTM après un stress réplicatif dans les cellules AF et corrigées par l’expression d’un gène FANC sauvage.
b) Le rôle des HPTM dans l'activation et la fonction de la voie FANC.
1.3 Voie FANC & protéines médiatrices (MDC1, 53BP1)
Les cellules exposées aux agents pontant l’ADN activent la voie ATR et le complexe FANCcore. Nous voulons déterminer les interactions biochimiques et fonctionnelles entre ATR, le complexe FANCcore et les protéines médiatrices MDC1 et 53BP1 en réponse à la mitomycine C et aux psoralènes photoactivés. Cette analyse contribuera à une meilleure définition des mécanismes d’élimination des pontages de l’ADN.
1.4 Voie Fanconi et sites fragiles
La réplication de l'ADN est activement coordonnée et contrôlée pour que le cycle cellulaire progresse dès l'achèvement de la duplication du génome en phase S. Toutefois, la réplication de sites fragiles peut être retardée jusqu’à la phase G2 du cycle. Les sites fragiles connus présentent des séquences répétées, avec le potentiel pour former des structures secondaires d’ADN pouvant entraver la progression de la fourche de réplication et conduire à la fragilité à ces sites. Nous avons montré qu’une réplication incomplète ou une résolution tardive des intermédiaires de réplication au niveau des sites fragiles induit des structures de chromatine anormales ciblées par FANCD2 pendant la mitose, produisant les ponts chromatiniens et ultrafins marqués par FANCD2-BLM à l'anaphase. Pour caractériser les mécanismes utilisés par les cellules de mammifères afin de conserver la stabilité génomique en G2-M après un stress réplicatif, nous proposons d’identifier les facteurs et les chemins moléculaires impliqués dans la réparation des anomalies induites par les stress réplicatifs.

2. Identification d’autres cibles du complexe FANCcore
Le complexe FANCcore est composé de 8 protéines FANC et d’autres protéines associées. Il possède une activité ubiquitine ligase stimulée par l’induction de dommages de l’ADN. Bien que la sous-unité FANCL de ce complexe soit responsable de cette activité in vitro, l’intégrité du complexe est nécessaire in vivo. A ce jour, seul deux substrats de ce complexe sont connus : FANCD2 et FANCI.
Afin d’identifier de nouveaux substrats du complexe FANC, nous nous proposons d’effectuer une analyse différentielle des protéines mono-ubiquitinylées dans des cellules AF (ne présentant pas de mono-ubiquitinylation de FANCD2) par rapport aux mêmes cellules corrigées par l’expression d’un gène FANC sauvage. Les protéines différentiellement mono-ubiquitynilées seront identifiées par spectrométrie de masse et validées par Western blot avant de procéder à la caractérisation de leurs fonctions cellulaires et de leurs interactions avec la voie FANC.

3. Voie FANC et cancers des voies aérodigestives supérieures (VADS)
Les cancers des voies aérodigestives supérieures (VADS) sont associés à des facteurs de risque environnementaux et de style de vie comme le tabagisme, la mastication du tabac et l’alcoolisme. En outre, un lien de causalité entre le papillomavirus humain (HPV) et un sous-ensemble de VADS a été clairement établi. Enfin, l’inactivation de la voie FANC a été associée à une susceptibilité accrue aux VADS. Ces facteurs de risque soulignent donc un rôle causal potentiel de dommages de l'ADN dans l'initiation et/ou la progression des cancers des VADS. Afin de mieux définir les étapes impliquées dans l’initiation et la progression des cancers des VADS, ainsi que les paramètres impliqués dans leur réponse à la chimiothérapie, nous voulons corréler les déficits génétiques liés aux mutations FANC, l’infection par le HPV, la chimiosensibilité et la stabilité génétique avec les caractéristiques cliniques, cellulaires et génétiques des VADS sporadiques.

Collaborations nationales et internationales

Collaborations nationales
Jean-Sebastien Hoffmann, Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (CRCT), Toulouse
Christel Guillouf, Institut Curie, Paris
Pierre-Henri Gaillard, Institut de Biologie Structurale et Moleculaire (IBSM), Marseille
Jean Soulier, Hôpital Sait-Louis, Paris
Pierre Fouchet et Lydia Riou, CEA, Fontenay-aux-Roses
Bernard Lopez et Pascal Bertrand, CEA, Fontenay-aux-Roses

Collaborations internationales
Pietro Pichierri, Istituto Superiore della Sanità, Roma
Januario Cabral-Neto, Universidad Federal de Rio de Janeiro, Rio de Janeiro

Activités d'enseignement

Filippo Rosselli dispense des cours magistraux dans plusieurs Masters 1 et 2 et Ecoles Doctorales dans les Universités de Paris V, Paris VI, Paris VII et Paris XI, à l’ENS de Cachan et à l’Institut Pasteur de Paris, pour un total annuel de plus de 30 heures

Thèses soutenues

Masters soutenus

Publications

2011
2010

Participation aux congrès

2011
2010
2009

Historique des stagiaires/visiteurs accueillis



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